胰島素抵抗(IR)是在慢性非傳染性疾病（高血壓、冠心病、糖尿病）與增齡過程中廣泛存在的重要病理生理改變，表現(xiàn)為體內(nèi)循環(huán)中胰島素濃度不低于正常水平而其生物效應(yīng)低下的狀態(tài)。
由于以人為對象進(jìn)行胰島素敏感性(IS)的研究受到較大的限制。因此，通過改變實驗條件誘發(fā)動物IS改變，建立相應(yīng)的動物模型已成為IS研究的重要方法。有證據(jù)表明攝食量與成分的變化可以導(dǎo)致機(jī)體血漿胰島素水平及IS的變化，如由于飲食原因引起單純性肥胖時出現(xiàn)的IR，以及熱量限制時出現(xiàn)的胰島素水平下降等。本研究選擇改變飼料攝入量與攝人成分的實驗條件，模擬攝食習(xí)慣變化對代謝影響的狀態(tài)，建立了以不同飼料配方與喂飼方式誘導(dǎo)IS改變的大鼠模型。對于IR在體研究具有一定的應(yīng)用意義。
材料與方法
一、材料
1．實驗動物：雄性SD大鼠132只，初始體重(198±14)g，購自中國人民解放軍總醫(yī)院動物實驗室。
2．動物飼料：(1)正常基礎(chǔ)飼料：普通商用基礎(chǔ)塊料，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所。(2)高脂高能量飼料：在參考文獻(xiàn)[5]基礎(chǔ)上調(diào)整配方，提高脂肪供熱量至59%，并相應(yīng)調(diào)整其他成分含量。由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所制備。兩種飼料成分及能量對比見表1。
二、實驗方法
1．動物分組與飼養(yǎng)：132只雄性SD大鼠分為三組，每組3個時間段，每個時間段用14只大鼠，7只用于鉗夾試驗，7只用于OGTT和其他檢測，每組有2只機(jī)動備用。各組大鼠均喂飼6個月，喂飼方式如下：(1)對照組：喂飼普通商用基礎(chǔ)塊料，自由攝食飲水；(2)肥胖組：喂飼高脂高能量塊料，自由攝食飲水,(3)限食組：為從喂飼高脂高能飼料至2個月時分出再喂飼普通商用基礎(chǔ)塊料，單籠(33cmX22 cmX13 cm)喂養(yǎng)，自由飲水，但限制食量為同齡大鼠每日進(jìn)食量的60%（約為16 g/d，40%的熱卡限制）。每日稱量投放的飼料。大鼠每周稱體重。三組大鼠在喂飼至2、4、6個月時采用正常血糖一高血漿胰島素鉗夾試驗檢測IS并進(jìn)行口服糖耐量試驗( oGrrT)，同時檢測大鼠體重、內(nèi)臟體脂重量及空腹血漿胰島素( FIns)水平。
2．正常血糖一高胰血漿島素鉗夾試驗：鉗夾試驗前一天下午大鼠用14%水合氯醛膠漿進(jìn)行腹腔內(nèi)注射麻醉(0.3 ml／l00g體重)。插管術(shù)后第二天上午進(jìn)行鉗夾實驗，操作過程見參考文獻(xiàn)[6]，取最后五次葡萄糖輸注速率( GIR)的平均值作為反映大鼠IS的指標(biāo)。
3．OGTT:大鼠按2g葡萄糖/kg體重計算灌服相當(dāng)計量的50%葡萄糖水，分別在服糖前及服糖后15、30、60、120 min時從尾部取血測定血糖值。
4．大鼠血標(biāo)本采集測定及內(nèi)臟脂肪質(zhì)量測定：各組OGTT后48 h的大鼠斷頭處死，肝素抗凝取血，取上清貯存于-80℃冰箱。血漿胰島素采用放射免疫法測定。取左側(cè)附睪周圍的全部脂肪，稱其濕重為內(nèi)臟脂肪質(zhì)量。
三、統(tǒng)計學(xué)處理
所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(r±s)表示，各項結(jié)果運(yùn)用SAS統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析(ANOVA)。
結(jié) 果
一、不同飼料配方及喂飼方式對大鼠體重、內(nèi)臟脂肪質(zhì)量的影響
使用不同飼料及采取不同的方式喂飼后，大鼠的外部體態(tài)、體重、內(nèi)臟脂肪質(zhì)量等方面都有不同程度的變化（表2）。至實驗結(jié)束時肥胖組大鼠體重顯著高于對照組；而限食組大鼠體重顯著低于其他各組。限食組大鼠體重與限食前相比減低了28.4%，與同齡對照組、肥胖組相比分別減低了47.9%和52.3%；
飼料
顆粒機(jī)、
秸稈顆粒機(jī)是養(yǎng)殖戶們生產(chǎn)顆粒飼料很好的選擇。
二、不同飼料配方及喂飼方式對大鼠IS的影響
在實驗結(jié)束時，兩種飼料及兩種不同喂飼狀況大鼠的IS由高到低依次為：限食組>對照組>肥胖組（圖1）。對照組大鼠的IS喂飼4個月中無明顯變化，但至6個月時下降了52.3% (P<0.01)。肥胖組大鼠2個月時就已出現(xiàn)IS明顯下降，并隨喂飼時間延長而不斷下降，與同齡對照組大鼠相比，2個月、4個月、6個月時分別低了55.O%、59. 5%、58.0% (P<0.01)。與同齡對照組及肥胖組大鼠相比，限食組大鼠IS始終維持在高敏狀態(tài)(P<0. 01)，實驗結(jié)束時限食組大鼠IS是肥胖組大鼠的10倍以上。
三、不同飼料配方及喂飼方式對大鼠OGTT結(jié)果的影響
不同飼料及喂飼狀態(tài)的大鼠出現(xiàn)不同的OG-TT結(jié)果（圖2）。對照組大鼠喂飼2個月、4個月時OGTT結(jié)果正常，實驗結(jié)束時超出正常值范圍，表現(xiàn)為糖耐量受損肥胖組大鼠喂飼2個月時服葡萄糖2h后血糖值(2 hPG)已表現(xiàn)為糖耐量受損，實驗結(jié)束時糖耐量受損程度進(jìn)一步加重。限食組大鼠OGTT始終維持在正常狀態(tài)，實驗結(jié)束時空腹血糖水平(FPG)和2 hPG在各組中最低。
四、不同飼料配方及喂飼方式下大鼠Flns水平
在6個月的喂養(yǎng)過程中，各組大鼠FIns變化見表3。對照組與肥胖組大鼠FIns在喂飼過程中均有增長趨勢；肥胖組大鼠FIns的增長趨勢較同齡對照組大鼠水平為高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。喂飼過程中，限食組大鼠Flns顯著低子其他兩組大鼠(P<0.05)。
五、不同飼料配方及喂飼方式模型的成功率
以高血漿胰島素一正常血糖鉗夾試驗測定IS的結(jié)果與預(yù)期結(jié)果的吻合率判定本模型制備的成功率。本實驗中共58只大鼠實施了鉗夾測定，獲得了53只大鼠的實測結(jié)果(鉗夾實驗成功率91.4%)，其中僅有2只的鉗夾測定結(jié)果與該組大鼠試驗預(yù)期結(jié)果方向不一致，模型的成功率達(dá)到96.2%。
討 論
飼料質(zhì)量和數(shù)量與機(jī)體代謝狀態(tài)密切相關(guān)，從而影響機(jī)體的IS及血漿胰島素水平，其中飼料質(zhì)量的影響尤為重要。本研究中使用的高脂高能飼料參考了已發(fā)表的配方，在不改變原配方蛋白含量并能加工成固體飼料的原則下，加大了脂肪比例。與普通商用飼料相比，能量高出40.5%；其中57. 9%的熱量由脂肪提供，脂肪提供總能量比普通商用飼料的12. 8%提高了3倍。這是導(dǎo)致食用這種飼料大鼠迅速出現(xiàn)體重增加，體脂堆積，IS下降和糖耐量受損的主要原因。以普通商用飼料不加限制的自由進(jìn)食方式喂養(yǎng)的對照組大鼠，隨喂飼時間延長，在大鼠基本完成生長發(fā)育之后，也出現(xiàn)了體內(nèi)脂肪堆積和IS下降，提示在飲食充足、無控制狀態(tài)的進(jìn)食情況下，大鼠也會隨著時間推移出現(xiàn)體脂積累，肥胖狀態(tài)發(fā)展，并由此造成IS下降等代謝紊亂現(xiàn)象。這點(diǎn)與人的通常情況相似。
高脂高能量飼料喂飼2個月后用自身對照的方式對這組中的部分大鼠用普通商用飼料進(jìn)行限食，每只每天食量攝入限定為對照組大鼠攝食量的60%左右。限食大鼠一般狀態(tài)良好，體重明顯降低，體脂蓄積明顯減少，IS大幅度升高，對糖負(fù)荷保持了良好的應(yīng)對狀態(tài)。提示適量的減低能量攝入，不僅能維持機(jī)體對胰島素的良好敏感狀態(tài)，還可以逆轉(zhuǎn)高脂高能量飼料造成的IR，恢復(fù)機(jī)體對糖負(fù)荷的一定承受能力，這與限食可以維持良好生理機(jī)能，減低疾病發(fā)生的報道相一致。
既往的報道多為高脂飼料喂養(yǎng)或直接靜脈輸入脂肪類物質(zhì)誘導(dǎo)的IR動物模型。本研究中使用的2種飼料配方及2種喂飼方法，快速經(jīng)濟(jì)易行，成模率高(>90%)，經(jīng)胰島素鉗夾試驗證實可以成功地制備出穩(wěn)定、可靠的不同IS的大鼠模型。用此模型模擬IS變化的自然過程、研究IS不同狀態(tài)（降低和升高）的機(jī)制和IR的干預(yù)措施是完全可行的。目前ATⅡ水平的升高，其中以心肌局部ATⅡ升高更為明顯。心肌ATⅡ不僅可由ACE途徑生成，還可由糜蛋白酶途徑生成。糜蛋白酶是一種糜蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，倉鼠、狗和人體內(nèi)的糜蛋白酶屬于a-糜蛋白酶，可裂解ATI分子中的Phe8-His9肽鍵而生成ATⅡ，多項體內(nèi)和體外研究均證實，糜蛋白酶在冠狀動脈粥樣硬化、心室肥厚、心肌纖維化的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。本實驗發(fā)現(xiàn)，糖尿病倉鼠心肌局部糜蛋白酶mRNA表達(dá)顯著升高，而ACE mRNA表達(dá)無顯著變化，提示心肌局部升高的ATⅡ可能來源于糜蛋白酶途徑。與本實驗的研究結(jié)果相似，Shiota等發(fā)現(xiàn)，兩腎一夾(2KIC)倉鼠心肌纖維化的發(fā)生是糜蛋白酶活化的結(jié)果，而與ACE無關(guān)。
研究還發(fā)現(xiàn)，糜蛋白酶還可通過促進(jìn)心肌局部炎癥反應(yīng)的發(fā)生和心肌局部基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs) c10]的活化而加重心肌纖維化的發(fā)生和心肌病變的進(jìn)程，這可能也是糜蛋白酶參與糖尿病心肌病變發(fā)生的機(jī)制之一。
總之，本實驗通過腹腔注射STZ成功誘導(dǎo)了糖尿病心肌病變倉鼠動物模型，并發(fā)現(xiàn)糖尿病心肌病變時伴有心肌局部ATⅡ水平的增高和糜蛋白酶基因表達(dá)的增強(qiáng)，提示糜蛋白酶可能參與糖尿病心肌病變的發(fā)生和發(fā)展，抑制糜蛋白酶的表達(dá)或活性可能具有治療作用。
