為了合理供給家兔飼料,滿足家兔對營養(yǎng)物質(zhì)的需求,必需對飼料的營養(yǎng)成分和營養(yǎng)價值進(jìn)行評定。評定飼料的營養(yǎng)價值,一方面需要測定飼料的營養(yǎng)物質(zhì)含量,另一方面需要了解這些營養(yǎng)物質(zhì)在畜體內(nèi)參與代謝轉(zhuǎn)化過程及產(chǎn)生的結(jié)果,這樣才可以對飼料的營養(yǎng)價值進(jìn)行全面深入和完善的評定。評定飼料營養(yǎng)成分含量的方法,主要是在實驗室進(jìn)行,有概略養(yǎng)分分析法、范氏纖維分析法和近紅外光譜分析等;評定飼料營養(yǎng)物質(zhì)可利用性的方法,一般采用動物試驗體內(nèi)法和體外評價兩種。
1、評定飼料營養(yǎng)成分含量
飼料中營養(yǎng)物質(zhì)含量的高低是評定飼料營養(yǎng)價值的最基礎(chǔ)的指標(biāo)。評定飼料營養(yǎng)成分含量一般在實驗室即可進(jìn)行,實驗室方法是一種成熟的可靠性高的方法。目前,飼料營養(yǎng)價值評定的實驗室方法分為兩類:一類為濕法分析,另一類為近紅外光譜分析(NIRS)。
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1.1濕法分析
目前飼料營養(yǎng)價值評定方法中普遍應(yīng)用的是濕法分析,即所有的分析項目需要對樣品進(jìn)行破壞處理,如酸、堿消化,有機(jī)溶劑浸提等,需要熟練的操作技術(shù)和較長的分析時間。
1.1.1概略養(yǎng)分分析法
飼料概略養(yǎng)分分析(飼料常規(guī)成分分析),即利用物理化學(xué)的基本原理和方法,通過對飼料中概略養(yǎng)分進(jìn)行分析測定,為評價飼料原料或產(chǎn)品的質(zhì)量提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。1862年德國Weende試驗站Hanneberg與Stohmann兩人創(chuàng)建了分析測定水分、灰分、粗蛋白、粗纖維及無氮浸出物的飼料傳統(tǒng)分析方案,即沿用至今的常規(guī)方法(韓友文,2004)。盡管此體系是飼料營養(yǎng)價值評定的基礎(chǔ),但僅根據(jù)化學(xué)成分分析并不能說明動物對飼料的消化利用情況,利用概略養(yǎng)分分析所測得的飼料養(yǎng)分與動物消化吸收養(yǎng)分間存在很大差異,因而不能較好地反映飼料的營養(yǎng)價值。
1.1.2范氏纖維分析法
近年來,用中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF),即范式洗滌纖維取代了粗纖維(cD,能更好的評價飼料的營養(yǎng)價值。范式洗滌法,又稱Van Soest洗滌纖維分析法,該法通過化學(xué)方法處理飼料樣品,所得的不溶性殘渣分別為NDF、ADF及酸性洗滌木質(zhì)素(ADL),由此可進(jìn)一步推算出飼料中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的含量。Van Soest體系在評定粗飼料營養(yǎng)價值方面較Weende體系有了長足的進(jìn)步,對粗纖維和無氮浸出物這兩個指標(biāo)進(jìn)行了修正和重新劃分,不僅給出了飼料中各種粗養(yǎng)分的測定值,而且給出飼料某種具體營養(yǎng)成分的含量。但是Weende體系和VanSoest體系都屬于靜態(tài)的表觀性指標(biāo),它們都沒有和動物發(fā)生聯(lián)系,使用過程中依舊存在一定的局限性。
1.2近紅外光譜分析
近紅外光是指介于可見光和中紅外光之間的電磁波,波長為780~2500nm。近紅外光譜方法(NIRS)利用有機(jī)物中含有OH、NH、CH、PH、SH等化學(xué)鍵的泛頻振動或轉(zhuǎn)動,以漫發(fā)射方式獲得在近紅外區(qū)的吸收光譜,通過多元線性回歸、主成分分析、偏最小二乘回歸、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、小波變換等現(xiàn)代化學(xué)計量學(xué)手段,建立物質(zhì)光譜與待測成分含量間的線形或非線形模型,從而實現(xiàn)用物質(zhì)近紅外光譜信息對待測成分含量的快速計算(張麗英.2002)。NIRS法具有速度快、操作簡單、污染小的特點,已成為分析領(lǐng)域的先導(dǎo)技術(shù)。在飼料成分分析中利用NIRS技術(shù),可以測定水分、粗蛋白質(zhì)、脂肪、糖、淀粉、纖維素、氨基酸等成分,甚至可估測飼料中的有效能值、可利用氨基酸等含量(計成,2008)。NIRS法不需要對樣品進(jìn)行破壞性處理,無需稱量,便于對飼料營養(yǎng)價值進(jìn)行即時監(jiān)測,但其缺點是利用近紅外光譜分析估計飼料營養(yǎng)物質(zhì)消化率必須建立在大量準(zhǔn)確的原始數(shù)據(jù)之上,否則,估測值與實測值差距很大。
Xiccatoa等(2003)采用近紅外反射光譜(NIRS)在6個歐洲試驗機(jī)構(gòu)采用相同的方法對164種試驗配合飼料預(yù)測其飼料化學(xué)成分、消化率和能值,通過2/3的樣品進(jìn)行測定,偏最小二乘回歸(PLSR)建立回歸方程,其余樣品作為驗證。結(jié)果顯示,化學(xué)組成預(yù)測干物質(zhì)、粗蛋白、粗脂肪、酸性洗滌纖維和淀粉較準(zhǔn)確,而粗纖維、中性洗滌纖維和總能的成分測定準(zhǔn)確性有所欠缺;消化率預(yù)測干物質(zhì)、總能和消化能較準(zhǔn)確,預(yù)測有機(jī)物、酸性洗滌木質(zhì)素、粗蛋白消化率較差;主要飼料組成預(yù)測接近飼料配方,尤其對添加脂肪、紫花苜蓿、甜菜渣、向日葵、麥麩和全株黑豆,但對于谷物(小麥除外)、小麥秸稈預(yù)測較差。
2、評定飼料營養(yǎng)物質(zhì)可利用性
對飼料營養(yǎng)成分含量進(jìn)行評定,只能說明飼料自身的質(zhì)量,不能說明動物對飼料的采食和利用情況,不足以準(zhǔn)確地反映出飼料的實際營養(yǎng)價值。評定一種飼料的營養(yǎng)價值最準(zhǔn)確、最直觀的方法就是動物試驗。但動物試驗費時、費力、費財,而體外評價法具有操作簡便,測定環(huán)境易于標(biāo)準(zhǔn)化,穩(wěn)定性高,重復(fù)性好,成本較低等優(yōu)點,因而越來越受到研究人員和企業(yè)界人士的廣泛關(guān)注。
2.1動物試驗體內(nèi)法
體內(nèi)法是直接評定飼料營養(yǎng)價值的方法,且測定的結(jié)果最接近正常的生理狀態(tài),具有可靠性和真實性。體內(nèi)法通過測定動物對飼料的采食量、消化率和利用率,以此評估飼料的營養(yǎng)價值。此方法準(zhǔn)確性好,是其他方法的標(biāo)準(zhǔn),其他評定方法都需用體內(nèi)法進(jìn)行校正,但是體內(nèi)法方法復(fù)雜,往往費時費力,需要一定數(shù)量的動物和大量的飼料樣品,不便于大規(guī)模進(jìn)行,且很難在短時間內(nèi)對大量的飼料樣品進(jìn)行評價分析。由于試驗動物個體間差異較大,試驗結(jié)果變異較大,重復(fù)性較差,不利于測定方法的標(biāo)準(zhǔn)化,限制了其實用性。另外,體內(nèi)法測定消化率的影響因素很多:日糧的頻繁更換帶來的應(yīng)激,不能反映家畜的正常生理狀況;標(biāo)記物不同測定的結(jié)果也不同;內(nèi)源氮的難于準(zhǔn)確估計也易造成誤差;糞樣的代表性及化學(xué)成分不同引起的誤差也在所難免。
2.2體外評價法
2.2.1酶解法
酶解法是用酶溶液代替消化液對飼料營養(yǎng)價值進(jìn)行評定的一種體外法。Ramos等(1992),Boisen(1991)在豬體外酶解法的基礎(chǔ)上,提出利用體外酶解法評價家兔飼料營養(yǎng)價值。Ramos和Carabano( J994)認(rèn)為,多酶法對預(yù)測家兔日糧營養(yǎng)價值具有很好的準(zhǔn)確性,并且經(jīng)獨立方差回歸模型進(jìn)行了驗證(Ramos,Carahano,1996),參數(shù)方程預(yù)測誤差在5%以下,因而被推薦作為家兔日糧營養(yǎng)評價的方法。同時試驗結(jié)果也預(yù)示了同一實驗室內(nèi)體外分析法的重復(fù)性和可信性,與Paqcual等( 2000)研究獲得的結(jié)果一致。操作步驟大致為:準(zhǔn)確稱取1g過Imm篩的粉狀樣品,加入25mL的磷酸鹽緩沖溶液(0.1M、pH值6.0),再加入lOmL 0.2M的HCI,用IM HCL和NAOH調(diào)節(jié)pH值至2,再加入1mL新鮮豬胃蛋白酶溶液,緩慢搖勻。將燒瓶封口后放人40%的水浴中消化1.5h后取出,加入10mL磷酸鹽緩沖液(0.2 M,pH值6.8)和5mL 0.6 M NaOH溶液,用HCI或NaOH將pH值調(diào)至6.8。混合搖勻,然后加入1mL豬胰酶溶液(sigma P-1790),封口,放入40℃的水浴中繼續(xù)消化3.5h。經(jīng)兩次培育,利用醋酸將pH調(diào)整到4.8,加入0.5mL 20%的硝基水楊酸,再次搖勻后將燒瓶封口后放入40C的水浴中消化16h。消化結(jié)束過濾末消化的殘渣,烘干稱重,可測定干物質(zhì)、蛋白質(zhì)、有機(jī)物質(zhì)和能量等養(yǎng)分的含量。計算消化率,并利用空白樣校正。
酶解法的優(yōu)點主要是測定環(huán)境易于標(biāo)準(zhǔn)化,穩(wěn)定性高,實驗室之間可比性強(qiáng),能大批量在實驗室進(jìn)行操作,效率高,成本較低,且不需要動物作為試驗供體。但是體外評價技術(shù)再現(xiàn)性研究較少,Xiccato等(1994)比較了UPADU和UPM兩個實驗室體外有機(jī)物消化率,得到不同的體外測定值,尤其是在高纖維日糧情況下。Carabano等(2008)研究實驗室之間體外酶解法,分析評價家兔干物質(zhì)消化率的變異性,結(jié)果表明體外分析法具有適宜的重復(fù)性和再現(xiàn)性,適合預(yù)測家兔營養(yǎng)價值的目的。
2.2.2接種培養(yǎng)法
糞液法,是用人工唾液稀釋的牛糞液或羊糞液代替瘤胃液對飼料營養(yǎng)價值進(jìn)行評定的一種體外法。Aderibighe等(1992),Fem6 ndez-Carmona等(1993)認(rèn)為可利用盲腸或消化道不同區(qū)段內(nèi)容物體外評價家兔飼料營養(yǎng)價值,F(xiàn)emd ndez-Carmona籌(1993)參考反芻動物(Lindgren,1979)和豬(Lo wgren,1988)的相關(guān)研究,提出利用盲腸內(nèi)容物接種法來評價飼料營養(yǎng)價值,糞便接種與此類似。主要操作步驟:取200g盲腸內(nèi)容物或糞便排泄物,二氧化碳充盈保護(hù)下,用320mL人工唾液稀釋于40C下分別浸化0.5和th并過濾,所稠盲腸內(nèi)容物和糞便溶液經(jīng)3500r/min離心5min,二爭化碳充盈保護(hù)下,向上層析出液加入1680mL人工唾液,獲得盲腸內(nèi)容物和糞便的接種液。準(zhǔn)確稱取111mm粉狀樣品加入50mL盲腸內(nèi)容物和糞便的接種液于預(yù)先干燥和稱重的消化玻璃管內(nèi),二氧化碳充盈保護(hù)下密封,每分鐘40次不斷攪拌條件下于40C的水浴中消化36h。培育完畢,收集未消化殘留物,按官方化學(xué)分析法測定未消化的干物質(zhì)和有機(jī)物殘留物,利用公式計算干物質(zhì)和有機(jī)物的體外消化率。該方法具有簡單、準(zhǔn)確、重復(fù)性好、可批量測定等優(yōu)點,但是有必要對此法適用的范同和方法的標(biāo)準(zhǔn)化做進(jìn)一步研究。
Pascual等(2000)利用不同體外方法比較評定家兔日糧營養(yǎng)價值,結(jié)果顯示酶解法測定的干物質(zhì)消化率極顯著高于糞便接種法,酶解法和盲腸內(nèi)容物接種法較化學(xué)分析獲得預(yù)測方程具有較高的準(zhǔn)確性,而糞便接種法具有較低的準(zhǔn)確性和變異性;三種方法重復(fù)性較好,酶解法顯著高于其他兩種,但是后兩者可信度極顯著低于酶解法。
2.2.3體外產(chǎn)氣法
由于反芻動物本身發(fā)酵的原因,體外產(chǎn)氣技術(shù)較多的應(yīng)用于評價反芻動物飼料的營養(yǎng)價值。Calabr6等(1999)將體外產(chǎn)氣技術(shù)用于預(yù)測家兔日糧營養(yǎng)價值和研究其發(fā)酵過程。該試驗以新鮮的盲腸內(nèi)容物和10種配合日糧作為反應(yīng)底物,試驗結(jié)果證實了利用體外產(chǎn)氣發(fā)準(zhǔn)確預(yù)測干物質(zhì)、有機(jī)物和總能消化率的可能性。操作步驟大致為:把干燥的0.82 g待測樣品與74mL基質(zhì)、3.5mL還原溶液、5mL盲腸消化液混合物在39aC下消化96h。同時設(shè)置空白對照校正有機(jī)物損失以及氣體產(chǎn)生。發(fā)酵過程每隔2~24h記錄產(chǎn)氣氣壓和體積,總計20次,且在最初的氣壓上升速度較快的48h時期增加讀數(shù)記錄。發(fā)酵結(jié)束收集殘留物,進(jìn)而利用公式求出待測飼料DM(干物質(zhì))或OM(有機(jī)物質(zhì))的消化率。體外產(chǎn)氣技術(shù)操作方法較易掌握,測定的數(shù)據(jù)重復(fù)性好,有較高的應(yīng)用價值,但同時還要考慮飼料成分、樣品的處理過程、緩沖液的改進(jìn)、培養(yǎng)物的標(biāo)準(zhǔn)化、以及自動化技術(shù)應(yīng)用等因素對評定飼料營養(yǎng)價值的影響,
Calabr6等(2000)利用家兔冷凍盲腸內(nèi)容物作為接種物研究混合日糧體外消化率,該法允許研究者有更多的時間用來獲得標(biāo)準(zhǔn)接種物的可用參數(shù),以及對更多數(shù)量的底物加以研究。該方法的優(yōu)點在于冷凍接種物可多次利用,在一定時間段內(nèi)結(jié)果可重復(fù)且可再現(xiàn)。Stanco等(2003)利用體外產(chǎn)氣技術(shù)研究發(fā)酵過程,試驗表明在3個月期間內(nèi),利用冷凍接種物可獲得相同的體外發(fā)酵參數(shù)。Stanco等(2003)研究表明體外產(chǎn)氣技術(shù)對預(yù)測家兔日糧營養(yǎng)價值是一種有意義的試驗方法,但是有必要進(jìn)一步加強(qiáng)對盲腸接種培養(yǎng)物標(biāo)準(zhǔn)化以及預(yù)測能力的調(diào)查研究。
3、結(jié)語
對各種飼料營養(yǎng)價值的準(zhǔn)確評價是科學(xué)配制動物日糧的前提,只有精確了解各種飼料所真正含有的營養(yǎng)價值及動物對各種營養(yǎng)物質(zhì)的需要量和動物對飼料的消化情況,才能合理地配制出真正符合動物生長需要又經(jīng)濟(jì)的飼料產(chǎn)品。在對家兔飼料營養(yǎng)價值評定的研究中,無論是評定營養(yǎng)成分含量,還是評定營養(yǎng)價值可利用性,各自方法都存在一定的優(yōu)點和缺點,在實際研究中有必要根據(jù)實際情況選擇適宜的評定方法。為提高評定結(jié)果的準(zhǔn)確性,目前的解決辦法就是在盡量做到精確的前提下,進(jìn)行更多的重復(fù),減少試驗室之間、人為操作過程及操作人員的誤差,同時制定一套標(biāo)準(zhǔn)的評價體系,對所使用的動物種類、年齡、動物試驗的環(huán)境、試驗動物所使用的飼料的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行統(tǒng)一的規(guī)定,這樣才能使所測的結(jié)果有可比性。另外,體外法的應(yīng)用研究可通過試劑標(biāo)準(zhǔn)化和精確化、設(shè)備精密化和自動化、操作機(jī)械化和簡單化、模擬仿生化和規(guī)模化,最大程度地消除實驗操作中造成的誤差,提高試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。